고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 원리 및 사용방법

혼합물을 분리할 때 가장 많이 사용하는 실험장비는 크로마토그래피입니다. 그중에서도 이동상이 액체인 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 일반적으로 실험실에서 가장 많이 사용하는 분석 실험 방법 중 하나입니다.

 

 

HPLC는 기체크로마토그래피(GC)와 동일한 원리를 가지고 있지만 열적으로 불안정하거나 극성이 큰 분자량을 갖는 화합물을 분리하는데 유용합니다. 그러면 HPLC의 원리와 구성요소, 사용방법에 대해서 알아보도록 하겠습니다.

 

 

HPLC란?

HPLC는 개별 모듈로 구성이 되어있지만 공간상의 문제로 특정한 틀 안에 통합된 상태로 만들어집니다. 매우 작은 관을 통해서 모듈 사이로 이동상이 흐르고 이 관은 스테인리스나 PEEK(Polyether-etherketone)으로 만들어져 있습니다. 이 관은 최대 압력 35 bar의 고압에서도 견딜 수 있게 디자인되어있습니다.

 

HPLC 기기

 

HPLC 구성요소

HPLC는 펌프와 주입기, 칼럼, 정지상, 검출기로 이루어져 있습니다. 각 구성요소에 대한 설명은 아래 자세히 작성해두었습니다. HPLC 장비를 이용하실 분들은 각 구성요소를 이해하고 장비를 사용해야 정확한 실험이 가능합니다.

 

 

1. 펌프

모든 HPLC 장비는 충전물이 가득 채워진 칼럼을 통해서 이동상의 흐름에 따라 이동합니다. 이 이동상의 흐름을 주기 위해서 펌프를 사용하는데 이동상의 흐름 속도와 점도, 정지상의 입자 크기에 따라서 압력이 최대 200 bar까지 증가합니다. 이러한 고압의 힘을 주기 위해서 펌프의 역할은 굉장히 중요합니다. 펌프는 이동상의 조성이 변하더라도 주기로 펄스를 가해 야하기 때문에 펌프는 HPLC에서 가장 중요한 구성 요소 중 하나입니다. 펌프는 이동상을 이동시킬 때 보다 완벽하게 흐름의 속도를 제어하기 위해서 펌프와 주입기 사이에 압력 감쇠기를 설치해야 합니다. 

 

HPLC 펌프

 

2. 주입기

HPLC 분석을 위해서는 시료를 칼럼으로 주입하는 주입기가 필요합니다. 안정적으로 흐름을 유지하기 위해서 가능한 한 빨리 시료를 정확한 부피로 주입해야 하기 때문에 수동으로 주입하는 경우에는 많은 연습이 필요합니다. 최근에는 자동 주입기가 설치되어있어 동일 한양의 시료를 주입기를 통해서 주입할 수 있게 되었습니다. 

 

3. 칼럼

칼럼은 HPLC의 가장 핵심 요소입니다. 칼럼에 채워진 정지상을 통해서 화합물이 분리되는 원리이기 때문입니다. 칼럼의 길이는 보통 3~15cm이고 내벽이 유리나 PEEK로 코팅이 되어있습니다. 칼럼의 분리 능력에 따라서 원하는 실험 결괏값을 얻을 수 있기 때문에 칼럼의 선택은 매우 중요합니다. 시료와 칼럼의 궁합이 맞지 않을 경우에는 칼럼이 다 막혀서 사용할 수 없게 됩니다. 그렇기 때문에 원하는 시료의 정보를 대략적으로 알고 칼럼을 선택하는 것이 중요합니다.

 

HPLC 칼럼

 

4. 정지상

이동상이 통과되고 이를 분리해주는 정지상은 이동상에 녹아 있는 화학물들과 상호 작용하여 검출기로 보내는 역할을 합니다. 정지상은 칼럼 안에 채워져 있고 주요 정지상 재료로는 실리카겔과 결합상 실리카, 산화알루미늄, 산화지르코늄이 있으며 분리하고자 하는 화합물에 적합한 정지상을 선택해야 효율적으로 분리할 수 있습니다. 적절한 정지상을 선택하기 위해서는 HPLC의 원리를 이해하고 수많은 경험이 필요합니다.

 

이동상과 정지상

 

5. 이동상

이동상은 분석하고자 하는 시료가 잘 녹는 용매로 적절하게 선택해야 합니다. 이동상은 정지상과 상호작용하여 물질을 분리하는데 그렇기 때문에 정지상에 따라서 이동상을 선택해야 합니다. 정지상이 극성이면 정상 크로마토그래피라고 하면 상대적으로 덜 극성인 이동상을 선택해야 합니다. 정지상이 비극성ㅇ일 경우에는 역상 크로마토그래피라고 부르고 이때는 이동상이 극성인 것을 사용해야 합니다.

 

 

6. 검출기

검출기는 정지상과 이동상의 극성 차이로 인해 분리된 화합물을 정량 분석하는 기기입니다. 검출기를 통해서 크로마토그래피 그래프가 나오고 이 면적을 적분하게 되면 화합물의 구성 비율을 계산할 수 있습니다. 그러나 정성분석을 하기 위해서는 기준 시료를 통해서 성분을 파악해야 하는 절차가 필요합니다. 대표적인 검출기로는 분광 광도법 검출기와 형광 검출기, 굴절률 검출기 등이 있습니다.

 

이상으로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 원리 및 사용방법에 대해서 알아보았습니다. 화학을 전공한 사람이라면 HPLC는 가장 기본적으로 알고 있을 겁니다. 하지만 실제 원리를 제대로 이해하고 있는 사람은 많지 않습니다. HPLC 기기로 분석을 하다 보면 성분분석이 안되기 때문에 결과를 해석하기 어려운 경우도 있습니다. 이런 경우에는 논문을 참고해서 HPLC의 이동상과 정지상을 다시 선택하고 실험 조건을 검토해야 합니다.